PCR, er pólýmerasa keðjuverkun, sem vísar til þess að dNTP, Mg2+, lengingarþættir og mögnunaraukningarþættir séu bættir við kerfið undir hvata DNA-pólýmerasa, með því að nota móður-DNA sem sniðmát og sérstaka primera sem upphafspunkt framlengingar, Í gegnum þrepin afeðlun, glæðingu, framlengingu o.s.frv., getur ferlið við að endurtaka dótturstrengs-DNA sem er viðbót við frumstrengjasniðmát-DNA í glasi, magnað upp hvaða mark-DNA sem er, fljótt og sérstaklega in vitro.
1. Hot Start PCR
Upphafstími mögnunar í hefðbundnum PCR er ekki að setja PCR vélina í PCR vélina og þá byrjar forritið að magna.Þegar uppsetningu kerfisins er lokið byrjar mögnunin, sem getur valdið ósértækri mögnun, og hot-start PCR getur leyst þetta vandamál.
Hvað er hot start PCR?Eftir að hvarfkerfið hefur verið útbúið losnar ensímbreytirinn við háan hita (venjulega hærra en 90°C) á upphafsstigi hvarfsins eða „hot start“ stigi, þannig að DNA-pólýmerasinn er virkjaður.Nákvæmur virkjunartími og hitastig fer eftir eðli DNA-pólýmerasans og heitbyrjunarbreytileikans.Þessi aðferð notar aðallega breytiefni eins og mótefni, sæknibindla eða efnafræðilega breytiefni til að hindra virkni DNA pólýmerasa.Þar sem virkni DNA pólýmerasa er hindruð við stofuhita, veitir heitræsingartækni mikla þægindi til að útbúa mörg PCR hvarfkerfi við stofuhita án þess að fórna sérhæfni PCR viðbragða.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse Transcription PCR) er tilraunatækni til að öfuga umritun úr mRNA í cDNA og nota það sem sniðmát til mögnunar.Tilraunaaðferðin er að draga út heildar-RNA í vefjum eða frumum fyrst, nota Oligo (dT) sem grunn, nota öfugrit til að búa til cDNA og nota síðan cDNA sem sniðmát fyrir PCR mögnun til að fá markgenið eða greina genatjáningu.
3. Flúrljómandi magn PCR
Flúrljómandi magn PCR (rauntíma magn PCR,RT-qPCR) vísar til aðferðar við að bæta flúrljómandi hópum við PCR hvarfkerfið, með því að nota uppsöfnun flúrljómandi merkja til að fylgjast með öllu PCR ferlinu í rauntíma og að lokum nota staðlaða ferilinn til að greina sniðmátið magnbundið.Algengar qPCR aðferðir eru SYBR Green I og TaqMan.
4. Hreiður PCR
Nested PCR vísar til notkunar á tveimur settum af PCR primers fyrir tvær umferðir af PCR mögnun, og mögnunarafurðin í annarri umferð er markgenbrotið.
Ef ósamræmi í fyrsta primerparinu (ytri primers) veldur því að ósérhæfð afurð er mögnuð, er möguleikinn á því að sama ósérhæfða svæðið þekkist af öðru primerparinu og haldi áfram að magna, þannig að mögnun með öðru pari primers, sérhæfni PCR hefur verið bætt.Einn kostur við að framkvæma tvær umferðir af PCR er að það hjálpar til við að magna upp nægilega afurð úr takmörkuðu upphafs-DNA.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR er aðferð til að bæta sértækni PCR viðbragða með því að stilla PCR hringrásarbreytur.
Í snertibundnu PCR er hitastigið fyrir fyrstu loturnar stillt nokkrum gráðum fyrir ofan hámarksglæðingarhitastig (Tm) grunnanna.Hærra hitastig við hitun getur á áhrifaríkan hátt dregið úr ósértækri mögnun, en á sama tíma mun hærra lofthitastig auka aðskilnað frumra og markraða, sem leiðir til minni PCR afraksturs.Þess vegna, í fyrstu lotunum, er hitastigið að lækka venjulega um 1°C á hverri lotu til að auka innihald markgensins í kerfinu.Þegar útglöðuhitastigið er lækkað niður í ákjósanlegasta hitastigið er hitastiginu haldið áfram í þær lotur sem eftir eru.
6. Bein PCR
Bein PCR vísar til mögnunar á mark-DNA beint úr sýninu án þess að þörf sé á kjarnsýrueinangrun og hreinsun.
Það eru tvær tegundir af beinum PCR:
bein aðferð: Taktu lítið magn af sýni og bættu því beint við PCR Master Mix til að auðkenna PCR;
sprunguaðferð: eftir sýnatöku úr sýninu, bætið því við lýsið, lýsið til að losa erfðamengið, takið lítið magn af lýstu floti og bætið því við PCR Master Mix, framkvæmið PCR auðkenningu.Þessi nálgun einfaldar tilraunavinnuflæðið, dregur úr vinnutíma og forðast DNA tap í hreinsunarskrefum.
7. SOE PCR
Genaskipti með PCR (SOE PCR) notar primera með sambótarendum til að láta PCR vörur mynda skarast keðjur, þannig að í síðari mögnunarviðbrögðum, í gegnum framlengingu skarastkeðjanna, eru mismunandi uppsprettur A tækni þar sem mögnuð brot skarast og splæst saman.Þessi tækni hefur nú tvær megin beitingarstefnur: smíði samruna gena;genastaðastýrð stökkbreyting.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) notar öfuga viðbótar frumra til að magna upp DNA brot önnur en frumurnar tvær og magnar óþekktar raðir á báðum hliðum þekkts DNA brots.
IPCR var upphaflega hannað til að ákvarða röð aðliggjandi óþekktra svæða, og er aðallega notað til að rannsaka genahvatarraðir;krabbameinsvaldandi endurröðun litninga, svo sem samruni gena, umfærslu og lögleiðingu;og veiru genasamþættingu, eru einnig almennt notuð núna. Fyrir staðstýrða stökkbreytingu, afritaðu plasmíð með æskilegri stökkbreytingu.
9. dPCR
Stafræn PCR (dPCR) er aðferð til að ákvarða heildarmagn kjarnsýrusameinda.
Núna eru þrjár aðferðir til að magngreina kjarnsýrusameindir.Ljósmæling byggir á gleypni kjarnsýrusameinda;rauntíma flúrljómandi magn PCR (Real Time PCR) byggir á Ct gildinu og Ct gildið vísar til hringrásarnúmersins sem samsvarar flúrljómunargildinu sem hægt er að greina;stafræn PCR er nýjasta megindlega tæknin sem byggir á einnar sameind PCR aðferð til að telja kjarnsýra magngreining er alger megindleg aðferð.
Birtingartími: 13-jún-2023