Notkun og varúðarráðstafanir á ofsíunarskilvinduröri
1) Veldu viðeigandi ofsíunarrör.Athugaðu að UF himnur eru mismunandi hvað varðar þol fyrir ýmsum efnum.Venjulega er hægt að velja ofursíunarrör með 10 kDa mólþungaskerðingu með mólþungaskerðingu sem ætti ekki að vera meiri en 1/3 af mólmassa próteinsins sem vekur áhuga, eins og 35 kDa.Ef mólþungi próteinsins sem vekur áhuga er um 10 kd, er hægt að nota ofsíunarrör með mólþyngdarskerðingu upp á 3 KD.
(2) Ofsíunin, nýkeypt, er þurr, með ofurhreinu vatni bætt út í fyrir notkun og vatn fer alveg í gegnum himnuna, ísbaðið eða ísskápinn forkælt í nokkrar mínútur.Vatninu er svo hellt af, þ.e. próteinvökvanum, og hversu miklu er bætt við, hvort sem er ekki meira en hvíta línan efst á túpunni.Aðgerðin er létt og ofsíunarrörið þarf að forkæla á ís áður en próteinlausninni er bætt við.
3) Bæði massi og þyngdarpunktur áttu að ná jafnvægi.Athugið að snúningshraði og hröðun er ekki mjög hröð, annars skemmir útsíunarhimnuna beint.Miðflótta ofsíun var hafin (skilvinda forkæld í 4 gráður).Eftir að snúningshraða mismunandi skilvinda var breytt í g var það öðruvísi.Hröðun skilvindunnar var stillt í lágmarki og minnkaði þrýstinginn á himnunni.Athugið, vertu viss um að yfirgefa skilvinduna eftir að skilvindan hefur náð ákvörðunarhraða, eða ef þú átt í vandræðum geturðu ekki höndlað það í fyrsta skipti.Stefna himnunnar að snældunni var stillt í samræmi við leiðbeiningarnar (hyrnt skilvinduhylki er himna á ás hornrétt).Í hagnýtri notkun er almennur snúningshraði lægri en í leiðbeiningunum, þannig að hægt sé að lengja líf skilvindurörsins.
3) Bæði massi og þyngdarpunktur áttu að ná jafnvægi.Athugið að snúningshraði og hröðun er ekki mjög hröð, annars skemmir útsíunarhimnuna beint.Miðflótta ofsíun var hafin (skilvinda forkæld í 4 gráður).Eftir að snúningshraða mismunandi skilvinda var breytt í g var það öðruvísi.Hröðun skilvindunnar var stillt í lágmark, sem minnkaði þrýstinginn á himnunni.Athugið, vertu viss um að yfirgefa skilvinduna eftir að skilvindan hefur náð ákvörðunarhraða, eða ef þú átt í vandræðum geturðu ekki höndlað það í fyrsta skipti.Stefna himnunnar að snældunni var stillt í samræmi við leiðbeiningarnar (hyrnt skilvinduhylki er himna á ás hornrétt).Í hagnýtri notkun er almennur snúningshraði lægri en í leiðbeiningunum, þannig að hægt sé að lengja líf skilvindurörsins.
(4) Þegar það hefur verið þétt í 1 ml sem eftir er skaltu taka 50 ul af jafnalausn, bæta við 10 ul af flæði í gegnum og athuga hvort það sé einhver blár litur, til að meta hvort prótein vantar í ofsíunarrörið.Ef túpan er lek, helltu aftur efra lagið og flæddu í gegnum það í nýtt slöngu til að hefja ofsíun.Til að ákvarða nákvæmlega hvort glösin hafi gleymst, skilið í 10 mínútur með 5mgml af BSA áður en það rennur í gegn, keyrt á próteinlími eða Bradford hráprófi og haldið áfram með því að bæta við óblandaðri próteinlausninni sem eftir er (sem virkar á ís og kemur í veg fyrir að prótein hitni) þar til öllu þykkninu hefur verið bætt út í.Gætið varúðar við skilvindu ef útfelling á próteinum á sér stað sem leiðir til lokunar slöngunnar.Ef úrkoma á sér stað, ákvarða hvort sérstök orsök úrkomu sé of mikill próteinstyrkur eða óviðeigandi jafnalausn;Hið fyrra er hægt að leysa með ofsíun margra útsíunarröra samtímis, minnka styrkinn og hið síðara með því að skipta á mismunandi jafnalausnum þar til engin útfelling á próteininu verður.
(4) Þegar það hefur verið þétt í 1 ml sem eftir er, taktu 50 ul af jafnalausn, bættu 10 ul af flæði í gegn og athugaðu hvort það sé einhver blár litur, til að meta hvort prótein vantar í ofsíunarrörið.Ef túpan er lek, helltu aftur efra lagið og flæddu í gegnum það í nýtt slöngu til að hefja ofsíun.Til að ákvarða nákvæmlega hvort glösin hafi misst af, skilið í 10 mínútur með 5mgml af BSA áður en það rennur í gegn, keyrt á próteinlími eða Bradford hráprófi og haldið áfram með því að bæta við óblandaðri próteinlausninni sem eftir er (sem virkar á ís og kemur í veg fyrir að prótein hitni) þar til öllu þykkninu hefur verið bætt út í.Gætið varúðar við skilvindu ef útfelling á próteinum á sér stað sem leiðir til lokunar slöngunnar.Ef úrkoma á sér stað, ákvarða hvort sérstök orsök úrkomu sé of mikill próteinstyrkur eða óviðeigandi jafnalausn;Hið fyrra er hægt að leysa með ofsíun margra útsíunarröra samtímis, minnka styrkinn og hið síðara með því að skipta á mismunandi jafnalausnum þar til engin útfelling á próteininu verður.
(5) Fyrstu skrefin eru notuð til að þétta próteinið og ef breyta á stuðpúðanum skaltu bæta nýjum jafnalausn (ofsíun í gegnum 0,22um ofsíunarhimnu) varlega í um það bil 1 ml af heildarpróteini og endurþykkja í um það bil 1 ml í þrjá samfellt, þar sem endanlegt einbeitt lokarúmmál fer eftir æskilegum próteinstyrk, venjulega ekki meira en 500 ul, en einnig innan við 200 ul.Náðu 1000 × eða meira þrisvar sinnum, í rauninni jafnmikil stuðpúðabreyting, eins og hún er reiknuð með að minnsta kosti 10 × eða svo magnauðgun í hvert skipti.
(5) Fyrstu skrefin eru notuð til að þétta próteinið og ef breyta á stuðpúðanum skaltu bæta nýjum jafnalausn (ofsíun í gegnum 0,22um ofsíunarhimnu) varlega í um það bil 1 ml af heildarpróteini og endurþykkja í um það bil 1 ml í þrjá samfellt, þar sem endanlegt einbeitt lokarúmmál fer eftir æskilegum próteinstyrk, venjulega ekki meira en 500 ul, en einnig innan við 200 ul.Náðu 1000 × eða meira þrisvar sinnum, í rauninni jafnmikil stuðpúðabreyting, og reiknuð með að minnsta kosti 10 × eða svo magnauðgun í hvert skipti.
Pósttími: Nóv-09-2022